摘要:目的 设计并筛选多条可高效特异性降低肿瘤细胞表面沉默程序性死亡受体-配体1(PD-L1)表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并研究其增强人CD8+T淋巴细胞对人胶质瘤细胞(U87MG)免疫杀伤作用。方法根据siRNA设计法则,并通过siDirect软件在线设计针对PD-L1基因的几种不同的siRNA序列,并运用BLAST进行同源性分析,最终确定候选序列;通过RT-qPCR、Westernblot及流式细胞术实验,选出高效抑制PD-L1mRNA及蛋白表达的siRNA序列;通过流式细胞术及CCK8检测PD-L1siRNA沉默U87MG细胞的PD-L1后,人CD8+T细胞对U87MG的细胞凋亡及增殖的影响。结果设计了10条针对人PD-L1基因具有不同核苷酸序列的siRNA。采用RT-qPCR、Westernblot及流式细胞术在mRNA及蛋白水平上检测siRNA的沉默效率,与对照组相比,siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著降低U87MG中PD-L1基因的表达(P<0.05),其中siPD-L1-3的沉默效率最高。与对照组相比,流式细胞术及CCK8结果显示,siPD-L1-3及siPD-L1-8均可显著增强人CD8+T细胞对U87MG细胞的杀伤作用,且该杀伤作用可显著抑制U87MG细胞增殖(P<0.05)。结论本文设计并筛选了能有效沉默PD-L1基因表达的siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8的6条序列,其中siPD-L1-3和siPD-L1-8可高效增强T淋巴细胞对U87MG细胞免疫杀伤作用,且siPD-L1-3的作用最为显著。本文设计的PD-L1siRNA分子可以用于设计和制备预防、治疗多种癌症的核酸药物。
       
       关键词:程序性死亡受体-配体1;小干扰RNA;神经胶质瘤细胞;CD8+T细胞;核酸药物
       
       
       3讨论
       研究发现,在神经胶质瘤患者体内,PD-L1的高表达能够增强肿瘤的转移及免疫逃逸能力,导致患者死亡率上升[19-20]。因此,设计小分子抑制剂、抗体或者siRNA抑制PD-1或PD-L1通路,从而利用机体T细胞直接杀灭肿瘤细胞,已成为肿瘤免疫疗法的热点[21-22]。RNA干扰效应分子有microRNA和siRNA等[23]。而siRNA因其效率高,且通过简单的化学合成即可获得,因而具有治疗疾病的应用前景[24-25]。目前国内外关于PD-L1及siRNA均有了较深入的研究,但是将两者结合起来研究的则甚少[26-27]。本研究利用siDirect在线设计,并通过运用BLAST在Genbank中进行同源性分析排除了与非靶基因有大于或等于15个碱基匹配的序列,双链Tm小于21.5℃,从而得到了10条候选siRNA序列,通过化学合成的方法获得候选siRNA分子。但由于mRNA可能存在二级结构,或者存在一些蛋白或核糖体的粘附,使得并不是所有候选序列都具有RNA干扰作用[28]。因此,需要通过实验筛选而得到最佳的siRNA序列。本实验采用阳离子脂质体法(lipofectamine2000),通过带正电的脂质体,与核酸带负电的磷酸骨架形成复合物,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,通过膜的融合或细胞内吞作用导入细胞内[23]。此法因其简单方便,细胞毒性低,重复性高,可以在siRNA浓度较低的条件下转染。