[摘要] 背景与目的:由己建立的小鼠基因打靶模型证实,K-ras突变启动了胰腺癌前病变—胰腺上皮 内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN),p53、p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润 性胰腺癌。作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4,本课题组前期研究提示,应用RNA干扰技术 沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达,促使PanIN细胞恶性转化。基于此目的,本研究进一步探讨siRNA干扰 Smad 4基因对PanIN细胞体内外增殖及转移能力的影响,从而有助于阐明PanIN恶性转化的新机制。方法:构建 和筛选能特异性静默PanIN细胞中Smad4表达的最佳siRNA稳定表达质粒,稳定转染最佳siRNA表达质粒进入PanIN 细胞,用Zeocin筛选稳定转染克隆,挑选阳性克隆、扩增,稳定转染后细胞命名为PanIN-S。本研究运用细胞 计数、克隆形成实验等分别比较两组在活细胞率和体外增殖能力的影响,同时为进一步验证Smad 4基因静默 对PanIN细胞体外迁移、侵袭能力的影响,本研究采用Transwell和Mitigel assay检测其干扰前后体外运动、 侵袭能力。动物实验中,建立PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型,并应用免疫组化方法检测并比较两组 PCNA、VEGF和MMP-9的表达及其差异。结果:成功构建了Smad4基因siRNA体系;体外实验中与PanIN组相比, PanIN-S组细胞增殖、侵袭能力明显增强,差异有统计学意义(P<0.05);动物模型免疫组化结果显示,与PanIN 组相比,PanIN-S组PCNA、VEGF和MMP-9表达显著增高(P<0.05)。结论:K-ras突变基础上小鼠PanIN细胞Smad4 基因静默促使PanIN细胞的恶性转化;PanIN基础上Smad4静默促使小鼠PanIN细胞体内外增殖及转移能力的增 强,其增殖及转移可能与PCNA、VEGF和MMP-9高表达有关。  
       [关键词] siRNA干扰;Smad4基因;胰腺上皮肉瘤变细胞;细胞增殖;转移
       
       3 讨  论   由于PanIN是近几年提出的新术语并被认 为是胰腺癌前病变,至今尚无他人分离和建立 PanIN细胞株。以前获得的有关Smad4在早期 PanIN细胞中表达而在后期PanIN和胰腺癌中缺 失的证据主要来源于对外科术后PanIN和胰腺 癌的混合性组织以及胰腺癌细胞株的分析而不 是来自对PanIN细胞的研究[4]。文献报道,在 PanIN及胰腺癌中Smad4基因突变率约50%,在 其他肿瘤中Smad4基因的失活频率通常<10%, 表明Smad4基因在PanIN及胰腺癌发生中是较特 异的肿瘤抑制基因,深入研究其恶性转化机制 具有重要意义[6]。抑癌基因Smad4是TGF-β信 号传导途径中的关键性中间传导分子[7],而 TGF-β是一种具有多功能活性的细胞因子,在 组织的发育、再生、修复中起重要作用,并与 肿瘤发生、转移等生物学改变密切相关。正常 情况下,TGF-β-Smad4 信号传导途径通过阻 断细胞周期中的G1/S转换和促进细胞凋亡而抑 制细胞生长。Smad4缺失将促进上皮-间质的转 换、细胞失控性生长等生物学效应,进而导致 肿瘤的发生。