[摘要] 背景与目的:微小RNA(microRNA,miRNA)是一类小分子内源性RNA,主要在转录后水平调节靶 基因的表达。microRNA-335(miR-335)作为一种肿瘤抑制因子,参与了多种人类肿瘤的发生、发展过程。本 研究旨在探讨miR-335是否靶向抑制Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil forming protein kinase,ROCK1)基因的表达,并以此调控人骨肉瘤细胞MG-63侵袭及转移。方法:理论预测并通过荧 光素酶基因报告验证miR-335与ROCK1基因的3'-非翻译区(untranslated region,UTR)的特异性结合作用; real-time PCR和蛋白质印迹法(Western blot)分别从基因和蛋白水平检测miR-335对ROCK1表达的负性调控作 用;Transwell小室法检测miR-335过表达及下调ROCK1表达后MG-63侵袭及转移能力的变化。结果:Targetscan 预测显示,miR-335与ROCK1 3'-UTR存在结合位点。荧光素酶基因报告实验结果显示,miR-335 mimic和 ROCK1 3'-UTR能够靶向结合;miR-335在MG-63细胞中低表达,ROCK1则呈高表达。Western blot检测结果显 示,转染miR-335 mimic或转染ROCK1 siRNA后ROCK1的蛋白表达减少。Transwell小室法检测结果显示,过表达 miR-335或下调ROCK1后穿过基膜的细胞数目明显下降。结论:miR-335能特异性结合于ROCK1基因的3'-UTR并 下调ROCK1的表达,抑制人骨肉瘤细胞MG-63侵袭转移。  
       [关键词] 微小RNA-335;Rho相关卷曲螺旋形成蛋白液酶1;人骨肉瘤细胞MG-63;侵袭及转移
       
       3 讨  论   在原发性骨肿瘤中,骨肉瘤的发病率仅 次于浆细胞骨髓瘤,居第2位,好发于10~25 岁青年,男女患者比例约为1.5∶1。骨肉瘤的 恶性程度很高,生长非常迅速,转移早,侵 袭性强,在临床上确诊时已有80%左右的患者 发生了肺部或其他部位的转移。目前,骨肉 瘤的治疗仍是主要针对于肿瘤整体,通过辅助 化疗和手术,虽可切除或杀灭大多数骨肉瘤 的肿瘤细胞,但仍很难阻止骨肉瘤的复发和 转移。   miRNA广泛存在于真核细胞生物中,是 一类在进化上高度保守的非编码小分子单链 RNA。miRNA可以通过碱基互补配对的方式识 别靶基因mRNA,使其直接降解或翻译抑制, 从而达到基因转录后调控的作用[11-12]。目前发 现miRNA 的表达与多种肿瘤相关,miRNA参与 多种肿瘤的发生及转移过程[13-16]。在肿瘤的发生、发展及转移过程中,这些miRNA可能起到 抑癌基因或癌基因的作用[17]。   表达miR-335的基因定位于人染色体第 7q32.2区,目前的研究发现,miR-335在不同 的肿瘤中发挥着不同的作用。miR-335在乳腺 癌、胃癌中低表达,过表达后抑制肿瘤侵袭转 移[18-19],发挥类似于抑癌基因的功能,而在星 形细胞瘤中高表达能促进肿瘤细胞增殖侵袭, 发挥癌基因的作用。本研究结果发现,在人骨 肉瘤细胞系MG-63中miR-335呈低表达,通过 细胞转染的方式将miR-335 mimic转染入骨肉 瘤细胞系MG-63中从而上调miR-335的表达; 进一步通过Transwell侵袭转移实验证实,miR335表达上调后,MG-63细胞侵袭及转移能力下 降,表明miR-335可抑制骨肉瘤细胞的侵袭及 转移。