关键词:肾脏;冰冻切片;免疫荧光

     

    组织冰冻切片、4%多聚甲醛、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二酸钾、烧杯、量筒、磁力搅拌器、10M NaOH溶液、吐温-20、triton x-100,正常驴血清、ddH2O、组化笔、移液器、一抗、荧光素标记的二抗、DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、荧光防淬灭剂、洗盒、无色指甲油、盖玻片、正置荧光显微镜

    7.2 主要试剂配制

    10XPBS(磷酸盐缓冲液)母液:称取80g氯化钠、2g氯化钾、35.8g磷酸氢二钠、2g磷酸二氢钾于1000ml烧杯中,加入800ml ddH2O,磁力搅拌器混匀至溶质完全溶解,使用将10M NaOH溶液将pH值调到7.4,再用ddH2O定容至1000ml,转移到蓝色广口瓶中室温长期保存。

    0.5‰ PBST溶液:将10XPBS(PH7.4)稀释10倍至1XPBS,加0.5ml吐温-20,混匀即可使用。

    1‰ triton x-100破膜液:10ml triton x-100加到10ml ddH2O中。

    5%驴血清封闭液:50ml正常驴血清,9950ml ddH2O。

    7.3 肾脏冰冻切片免疫荧光实验步骤

    1)对于O.C.T.包埋的肾脏冰冻组织,用冰冻切片机切成5mm厚的冰冻切片,长期保存在-80℃冰箱;

    2)将冰冻切片取出,室温干燥10min(没有水汽);

    3)用组化笔沿组织周围化圈,后组织上滴加4%多聚甲醛固定10min;

    4)0.5‰ PBST洗5min*3;

    5) 1‰ triton x-100 溶液破膜15min (唯独Ki67需要步骤5和6,其余直接到步骤7);

    6)0.5‰PBST洗5min*3;

    7)5%驴血清封闭液室温封闭1h;

    8)一抗按合适比例用1XPBS(两个抗体则需如1:500 LYVE-1,1:50 Ki67混合孵育)稀释后,滴加在组织上,1XPBS作阴性对照,4℃避光孵育过夜(16h-19h);

    9)第二天切片从冰箱取出恢复至室温(约30min);

    10)0.5‰PBST洗5min*3;

    11)荧光素标记的荧光二抗用1XPBS稀释500倍(两个二抗则需如Alexa 488 驴抗兔荧光/二抗Cy3驴抗山羊荧光二抗混合孵育),二抗37℃或者室温孵育1h;

    12)0.5‰PBST洗5min*3;

    13)DAPI染核5min;

    14)0.5‰PBST洗5min*3;

    15)滴加适量荧光防淬灭剂,用盖玻片封片,盖玻片周围用无色指甲油加固防止滑动损伤组织;

    16)正置荧光显微镜拍照。

    注:4%多聚甲醛固定后防止干片;二抗孵育开始注意避光;混合孵育时两个一抗须为不同种属来源,二抗则选择不同颜色荧光素标记的。