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ELISA测定ChAT和AChE含量
发布时间:2019-04-10 11:59:36| 浏览次数:
TAG: ELISA ChAT AChE

    关键词:ELISA ;ChAT ;AChE

     

      用ELISA 试剂盒检测样本ChAT 和AChE 含量。实验操作严格按产品说明书进行,步骤如下:

    切割标本后,称取重量,加入一定量的PBS,PH 7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍保持2-8℃,加入一定量的PBS,PH 7.4,用匀浆器将标本匀浆充分。2000-3000 转/分,离心20 分钟,收集上清,若不能立刻应用,则冷冻备用。

    2.6.1 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准孔10 孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔,再在第三孔和第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉,再各取50μl 分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中,再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九、第十孔中各取50μl 弃掉。(ChAT 稀释后各孔的最终浓度分别为180pg/ml, 120pg/ml,60pg/ml, 30pg/ml, 15pg/ml; AChE 稀释后各孔的最终浓度分别为360pg/ml,240pg/ml, 120pg/ml, 60pg/ml, 30pg/ml)。

    2.6.2 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

    2.6.3 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。

    2.6.4 配液:将30(48T 的20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T 的20倍)倍稀释后备用。

    2.6.5 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此重复5 次,拍干。

    2.6.6 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

    2.6.7 温育:操作同3。

    2.6.8 洗涤:操作同5。

    2.6.9 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15 分钟。

    2.6.10 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色转为黄色)。

    2.6.11 测定:以空白孔调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

    2.6.12 样品浓度计算:用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

     


 
 
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