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细胞凋亡检测实验方法与步骤
发布时间:2019-04-08 10:21:56| 浏览次数:
TAG: 细胞凋亡

    关键词:细胞凋亡

     

      应用细胞凋亡检测试剂盒检测DATS处理骨肉瘤细胞MG63和MNNG/HOS后的细胞凋亡比率,观察DATS对骨肉瘤细胞凋亡的影响。在细胞凋亡过程中,细胞膜上面的磷酯酰丝氨酸由脂膜内侧翻到外侧,可以与Ca2+依赖性磷脂结合蛋白Annexin V特异性结合,用标记了FITC的Annexin V作为荧光探针,可以区分正常细胞与凋亡与坏死细胞。而应用PI这种不能透过完整细胞膜的核酸染料作为标记,可以区分是早期凋亡细胞还是晚期凋亡细胞或坏死细胞。这样在流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为双阴性FITC-PI-,右上象限为晚期凋亡或坏死细胞,为双阳性FITC+/PI+,右下象限为早期凋亡细胞FITC+/PI-。主要实验步骤如下:

    (1)将对数期生长的骨肉瘤细胞MG63和MNNG/HOS分别接种于6孔培养板,细胞密度为2 X i05个/2 ml/孔,培养过夜待其贴壁。

    (2)去除原培养基,分别加入2ml含不同浓度DATS的培养基(0,20,40,80 u M),常规孵育24或48小时。在其余分组细胞中,用NAC 5 uM预处理细胞2小时后,加入DATS共同处理细胞24或48小时。

    (3)刺激结束后常规消化离心细胞,用冷PBS洗涤细胞2次,离心弃上清。用1×Binding Buffer 500 u l重悬细胞,转入BD流式管。

    (4)实验组每管加FITC—Annexin V染液5 u l和PI染液5 u 1,对照组分为空白对照管,单标FITC—Annexin V管,单标PI管,双标FITC—AnnexinV和PI管。

    (5)轻轻混匀后室温避光孵育15分钟。

    (6)1小时内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,激发波长488nm,FITC绿色荧光通过FLI通道检测,PI红色荧光通过FL2通道检测。FlowJo软件计算细胞凋亡比率。


 
 
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